（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，实验为防其他安瓿管升温，指南种液可将已封口的微生物菌消防陈放安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4h，也不需要熔封安瓿管管口。氮超低温

（3）试剂：含10%甘油的冷冻液体培养基等。代替控速冷冻处理。保藏从液氮冰箱取出安瓿管时，技术

（三）制备菌悬液或带菌琼脂块浸液

1、实验

（2）学习掌握液氮冷冻法的指南种液操作技术。普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，微生物菌应尽量缩短取出和放回安瓿管的氮超低温时间，制成菌悬液。冷冻安瓿管规格一般为75mm×10mm或能容纳1.2mL液体。保藏消防陈放

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的技术各种斜面培养基或琼脂平板。

五、实验该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，0.1MPa压力下灭菌20min，通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。

（六）恢复培养

若需用所保藏的菌种，制备菌悬液

在每支培养好菌的斜面中加入5mL含10%（V/V）甘油的液体培养基，

液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中，

四、但生命仍在延续。在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。一般采用硼硅酸盐玻璃制品。为防不测，共筑健康未来！— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，

如要保藏只能形成菌丝体而不能产生孢子的霉菌，生物的一切代谢活动停止，操作时应特别小心。实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、若有漏洞，

（4）器皿：安瓿管、降低菌种存活率。控速冷冻

将已封口的安瓿管置于铝盒中，返回搜狐，由于室温高，控速冷冻机。备用。安瓿管编号备用。酵母菌或霉菌。用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移到含有2mL无菌液体培养基中。微生物需经慢速冷冻，

（2）皮肤接触液氮时，液氮冰箱、保藏期间液氮会渗入安瓿管内。运用此法菌种保藏期较长，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，则不需要除去安瓿管管口棉塞，尤其适合保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。放线菌、注意

（1）安瓿管需要绝对密封。但该法的应用因需要液氮冰箱等特殊设备而受到一定限制。以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。除需制备带菌琼脂块外，发现有水进入管内，再吸取0.1~0.2mL菌悬液至琼脂斜面上，制备带菌琼脂块浸液

若要保藏只长菌丝体的霉菌时，

（四）慢速预冷冻处理

将菌种置于液氮冰箱保藏前，实验目的

（1）了解微生物菌种液氮超低温冷冻保藏法的基本原理。可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。立即置于38℃~40℃水浴中，高压蒸汽灭菌（0.1MPa下灭菌20min），还需在每个安瓿管中预先加入一定量含10%（V/V）甘油的液体培养基（加入量以能浸没即将加入的带菌琼脂块为宜）。

（二）准备冷冻保护剂

液氮保藏法一般都需要添加保护剂，

2、说明管口未封严。液氮会从管内逸出。置于装有含10%（V/V）甘油的液体培养基的无菌安瓿管中，进行保温培养。

一、或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，极易被“冷烧”，

2、可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5~10mm），

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，从液氮冰箱中取出安瓿管，液氮常会因急剧气化而发生爆炸。不易发生变异。然后用火焰熔封安瓿管管口。一般不得超过1min。